過氧化氫酶是一種普遍存在于自然界的血紅素鐵酶，其活性主要是分解H2O2產(chǎn)生H2O和O2，以保護生物體不被過氧化氫所毒害，目前該酶的主要研究方向為H2O2的分解機制及其生理功能，而過氧化氫酶的O2的代謝利用機制尚未見報道。前期研究發(fā)現(xiàn)，過氧化氫酶EasC利用O2催化麥角生物堿核心骨架四并環(huán)結(jié)構(gòu)中C環(huán)合成時并不需要額外添加NADPH等還原劑，推測其可能代表著一種未知的氧氣激活與氧同化機制。

　　近日，中國科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所高書山團隊與杭州師范大學(xué)郭瑞庭團隊合作，破解了EasC蛋白底物復(fù)合體結(jié)構(gòu)，并利用波譜測定、體外生化、同位素標(biāo)記和化學(xué)計算等手段，從分子水平闡明了EasC利用O2催化氧化環(huán)化反應(yīng)的新機制。團隊首先通過電鏡獲得EasC酶與底物PCC的復(fù)合體結(jié)構(gòu)（2.33 ?），發(fā)現(xiàn)EasC呈現(xiàn)二聚體結(jié)構(gòu)，并且發(fā)現(xiàn)PCC并不是結(jié)合在heme口袋上方，而是結(jié)合在過氧化氫酶共有的NADPH口袋，該位置距離heme口袋20.7 ?，兩口袋之間通過一個狹長活性氧傳輸通道相連。為了探究EasC參與催化反應(yīng)的鐵氧復(fù)合物類型，隨后團隊對酶的波譜特征進(jìn)行了檢測。在有氧條件下，將底物PCC和EasC酶（靜息態(tài)Fe(III)）進(jìn)行快速混合，使用停留色譜檢測到了416、544 和590 nm的最大吸收，該吸收明顯區(qū)別于血紅素酶已報道的鐵-氧復(fù)合體Compound I (Cpd I,Fe(IV)=O) 的最大吸收（408 和650 nm），反而與文獻(xiàn)報道的Compound III(Cpd III,Fe(III)-O2·-）吸收一致，表明EasC中的血紅素鐵可能以Cpd III的方式參與催化反應(yīng)。進(jìn)一步的電子順磁共振和紫外吸收測試表明，在有氧條件下，靜息態(tài)EasC的Fe(III)接收底物電子并與O2結(jié)合耦合、直接形成Cpd III。由于Cpd III可以分解生成超氧陰離子（O2·-）并回歸到靜息態(tài)Fe(III)，團隊推測EasC催化過程可能由超氧陰離子介導(dǎo)。因此該研究進(jìn)一步通過活性氧抑制實驗、超氧陰離子恢復(fù)實驗以及18O標(biāo)記的超氧陰離子自由基競爭性實驗，鑒定出氧氣被活化成超氧陰離子（O2·-）的活性氧形式、參與底物的轉(zhuǎn)化，而非傳統(tǒng)的鐵-氧復(fù)合物轉(zhuǎn)化底物。

　　基于以上實驗結(jié)果，團隊提出了基于活性氧超氧陰離子的反應(yīng)機制：i)結(jié)合在NADPH口袋的底物PCC，其吲哚氨基將一個電子傳遞給血紅素口袋的Fe(III)，后者同時和氧氣結(jié)合形成Fe(III)-O2·- (Cpd III)；ii)Cpd III進(jìn)一步分解成Fe(III)和超氧陰離子（O2·-），生成的超氧陰離子通過兩個口袋之間的ROS通道進(jìn)入NADPH口袋；iii)超氧陰離子與底物PCC結(jié)合，催化復(fù)雜的氧化環(huán)化反應(yīng)，完成麥角生物堿C環(huán)的合成。

　　綜上所述，該研究詳細(xì)闡明了麥角生物堿核心骨架C環(huán)的生物合成機制，發(fā)現(xiàn)過氧化氫酶EasC利用超氧陰離子實現(xiàn)氧氣激活，并進(jìn)一步催化氧化環(huán)化反應(yīng)。該機制代表了一種全新的血紅素金屬酶的催化模式，即氧氣無需形成活性鐵-氧復(fù)合物。同時，該研究也讓過氧化氫酶的相關(guān)研究從H2O2依賴性酶轉(zhuǎn)向O2依賴性酶，拓展了過氧化氫酶這一生物催化劑的研究領(lǐng)域。

　　該工作得到了國家重點研發(fā)計劃、國家自然科學(xué)基金、天津市合成生物技術(shù)創(chuàng)新能力提升行動、湖北紅山實驗室項目、杭州師范大學(xué)交叉學(xué)科研究項目以及中國科學(xué)院戰(zhàn)略性先導(dǎo)科技專項等項目支持，相關(guān)成果發(fā)表于Nature期刊。杭州師范大學(xué)陳純琪教授、博士生劉紫薇，中國科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所客座博士生禹之璞、中國科學(xué)院微生物研究所副研究員姚永鵬為本文的共同第一作者，高書山研究員和郭瑞庭研究員為本文的共同通訊作者。低碳合成工程生物學(xué)全國重點實驗室和工業(yè)酶國家工程研究中心相關(guān)科研人員在本項工作中做出了重要貢獻(xiàn)。